СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЛЮНЫ

Обычно исследованию подвергаются предметы и объекты, на которых присутствие слюны наиболее вероятно (окурки, кляпы, почтовые конверты и марки, следы от укуса, продукты питания).

При этом эксперт обязан дать ответы на следующие вопросы:

1. Имеется ли на представленных для исследования объектах слюна?

2. Какова ее групповая принадлежность?

3. Может ли слюна принадлежать данному конкретному лицу?

Как правило, на окурках, которые имеют признаки пребывания во рту, присутствие слюны, в виду ее заведомого наличия, специально не определяется. Исследование остальных объектов на наличие слюны является обязательным. Пятна слюны обычно имеют беловатый или желтоватый цвет. Предварительный поиск слюны на представленных объектах производится с помощью ультрафиолетового облучения, в лучах которого слюна дает голубоватое свечение.

Достоверной методикой обнаружения слюны является реакция Моллера на амилазу в модификации Барсегянц. В качестве реагента используется раствор Люголя любой концентрации, которым обрабатывают вытяжки из пятен подозрительных на наличие слюны в смеси с картофельным крахмалом. Как известно, раствор Люголя при взаимодействии с крахмалом приобретает синее окрашивание. При наличии в исследуемых вытяжках амилазы, последняя расщепляет крахмал, раствор становится прозрачным и не изменяет свою окраску при добавлении раствора Люголя. Данная реакция отличается достаточно высокой чувствительностью (позволяет исследовать небольшие участки материала со следами различной давности) и специфичностью (не дает положительного результата со спермой, кровью, влагалищным содержимым).

У лиц, страдающих сахарным диабетом, может наблюдаться положительная реакция Моллера с мочой.

Групповые свойства слюны по системе АВО определяют теми же методиками, что и в следах спермы. Перед проведением реакций на группоспецифические антигены слюны, предварительно устанавливают категорию выделительства проходящих по делу лиц.

Индивидуальную принадлежность слюны определяют методом генотипической идентификации.

6. СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОТА И МОЧИ

 

При экспертизе этих выделений на разрешение экспертизы ставятся следующие вопросы:

1. Присутствуют ли на представленных объектах потовые выделения (моча)?

2. Какова групповая принадлежность пота (мочи)?

3. Какова индивидуальная принадлежность потовых выделений (мочи)?

Потовые выделения обычно обнаруживаются на различных предметах одежды, изъятых с места происшествия или при других обстоятельствах. Иногда, при отсутствии других биологических выделений, целесообразно исследовать пятна пота с целью определения принадлежности той или иной вещи конкретному человеку.

Вопрос о наличии потовых выделений на длительно ношеных предметах: головные уборы, носки, чулки, обувь и др. не ставится, так как подразумевается неизбежное присутствие пота на этих объектах. Установление наличия пота на спичках, в подногтевым содержимом, на окурках проводить не рекомендуется из-за неспецифичности результатов.

Достоверным методом установления наличия пота является реакция, основанная на выявлении аминокислоты серина и разработанная Л.О. Барсегянц. Сущность реакции заключается в окислении серина с образованием формальдегида, дающего цветную реакцию с хромотроповой кислотой. Изменение окраски раствора свидетельствует о наличии серина, а значит, и пота в исследуемом пятне.

Видовую принадлежность пота устанавливают крайне редко (методом встречного ИЭФ).

Групповая специфичность потовых выделений определяется посредством реакции абсорбции-элюции. Для более достоверной идентификации возможно применение ПЦР.

Для обнаружения мочи используется метод, основанный на обнаружении креатинина или мочевины. Содержание креатинина в моче максимально, в отличие от его содержания в крови и других выделениях. Для его выявления применяется реакция образования берлинской лазури, которая обладает достаточной специфичностью и может использоваться в судебно-медицинской практике. Суть реакции сводится к взаимодействию креатинина с нитропруссидом натрия и ледяной уксусной кислотой с последующим окрашиванием раствора в сине-зеленый цвет (образование берлинской лазури). Данная реакция обладает высокой чувствительностью и позволяет, при ее точном техническом исполнении, выявить мочу даже в смеси с кровью или другими выделениями.

Уничтожение мочи путем даже кратковременного застирывания в чистой воде препятствует ее выявлению с помощью вышеописанной реакции.

Обнаружение мочи реакциями, направленными на выявление мочевины, не получило широкого практического применения. Тем не менее, возможно определение присутствия мочевины с помощью реактива Несслера (йодистый калий, гидроксид калия, хлорид ртути, дистиллированная вода). В пробирку помещают фрагмент исследуемого пятна, добавляют дистиллированную воду и уреазу. На край пробирки помещают кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной реактивом Несслера. При ферментативном расщеплении мочевины образуется аммиак, в результате чего фильтровальная бумага приобретает коричневую окраску.

Вид мочи практически никогда не определяют из-за отсутствия в ней достаточного количества белка (в исключительных случаях используют РИФ).

Групповая принадлежность мочи устанавливается реакцией абсорбции-элюции по системе АВО.

Идентификационные исследования с мочой производят редко, но с этой целью может быть использован ДНК-анализ. Кроме того, вывод о возможной принадлежности мочи конкретному лицу может быть сделан уже на основании изучения групповой специфичности мочи.

 

 

7. ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ

 

Впервые ДНК-типирование в судебно-медицинских целях было использовано в 1985 году профессором Лестерского университета Великобритании А. Джефрисом. В начале 90-х годов ХХ столетия для исследования вариабельных фрагментов ДНК впервые была применена полимеразная цепная реакция (ПЦР), разработанная американским ученым К. Мюллисом. Чрезвычайно высокая достоверность и универсальность метода дала импульс к ее широкому применению не только в судебно-медицинских целях, но и в других отраслях медицинской науки.

Структура ДНК каждого отдельно взятого человека в достаточной степени уникальна. Именно это определяет фенотипическое разнообразие человеческих популяций. Каждый человек характеризуется строго индивидуальным, присущим только ему, набором фенотипических признаков. Такой полиморфизм является отображением генетического многообразия наследственной информации.

ДНК содержит 3 класса последовательностей:

1. Сателлитная ДНК.

2. Умеренные повторы.

3. Уникальные участки ДНК.

Сателлитная ДНК, не кодирует информацию о структуре белков, образована многократно повторяющимися (сотни тысяч раз) нуклеотидными последовательностями, которые сгруппированы в однородные фрагменты.

Умеренные повторы ДНК содержат десятки тысяч повторяющихся нуклеотидных последовательностей (тандемных повторов) отличающихся по длине, локализации и последовательности азотистых оснований.

Уникальные участки ДНК представлены неповторяющимися, единичными нуклеотидными последовательностями, на их долю приходится около 70% ДНК генома и она кодирует большую часть синтезируемых в клетке белков. Полиморфизм уникальных участков ДНК определяется строго индивидуальной первичной последовательностью нуклеотидов в геномах сравниваемых индивидов.

Полиморфизм (разнообразие) сателлитной ДНК в геномах различных индивидуумов обусловлен либо неодинаковой длиной тандемных повторов, либо различной их локализацией на протяжении молекулы ДНК.

Метод генотипической идентификации основан на выявлении вариабельных фрагментов ДНК, которые не только индивидуальны, но и повторяются во всех клетках организма каждого отдельно взятого человека. Метод является максимально достоверным, точным и универсальным, так как применим для идентификации самых различных объектов биологического происхождения. При высокоточном техническом исполнении метода возможность получения ошибочного результата менее одного на несколько миллиардов случаев. Учитывая количество людей, населяющих Землю, с математической точки зрения, вполне оправдано допустить, что вероятность ошибки стремится к нулю. Таким образом, используя метод ДНК-анализа, можно выделить одного-единственного индивидуума из всего множества живущих на Земле.
Полное совпадение генотипов может наблюдаться только у однояйцевых близнецов, однако даже в этом случае, вследствие точечных мутаций в период раннего эмбриогенеза, возможны различия в структуре единичных нуклеотидов.

В настоящее время идентификационное исследование ДНК осуществляется через ряд последовательных этапов.

Первоначально производят экстрагирование ДНК, т.е. выделение ее из биологических объектов. В свою очередь этот этап подразделяется на несколько стадий.

1. Размельчение и гомогенизация биологического материала. Первоначально объект подвергается механическому измельчению. В дальнейшем исследуемый материал помещается в экстрагирующий раствор, содержащий детергент, буферные соединения и фермент протеиназу К. Таким образом, одновременно  с гомогенизацией осуществляется протеолитическое расщепление биологического материала.

2. Удаление белковых фрагментов. В результате ферментативного распада белка образуется раствор, содержащий смесь пептидов различной длины и ДНК. Затем гомогенизированный материал обрабатывается смесью фенола и хлороформа. Чрезвычайно эффективно использование комплексного реактива Chelex 100, который способен в течении часа выделить необходимое количество ДНК.

3. Осаждение ДНК. С этой целью чаще всего используют 70% этиловый спирт. Нередко, когда количества ДНК в исследуемом биологическом материале недостаточно, ее полного осаждения не происходит. Поэтому, в таких случаях целесообразно внесение в полученный раствор ДНК дрожжевой РНК. При этом создается достаточно высокая общая концентрация нуклеиновых кислот в растворе, что способствует их более эффективному осаждению этиловым спиртом. Дрожжевая РНК является индифферентным веществом по отношению к выделенной ДНК и поэтому не оказывает влияния на процесс ее дальнейшего исследования.

4. Рестрикция полинуклеотидной цепи. После выделения ДНК ее обрабатывают  специфическими эндонуклеазами (рестриктазами), которые рестриктируют («нарезают») цепочку ДНК в строго определенных точках в соответствии с химической структурой каждой из рестриктаз. В результате образуется смесь фрагментов ДНК с различной длиной и молекулярной массой.

В дальнейшем анализ полиморфизма ядерной ДНК производят с помощью полимеразной цепной реакции. Основу полимеразной цепной реакции составляет процесс амплификации (умножение, увеличение) определенных локусов, осуществляемый с помощью фермента ДНК-полимеразы, обеспечивающей синтез новой цепочки ДНК, идентичной исследуемой.

Ценность и эффективность этого метода заключается в том, что он позволяет получить неограниченное количество копий интересующего фрагмента исследуемой ДНК при минимальных затратах. Высокая чувствительность ПЦР делает возможным исследование объектов малой величины (единичные волосяные луковицы, отдельные чешуйки перхоти, следовые количества крови, спермы, слюны).

Участок ДНК, подвергаемый амплификации, ограничивают внесением в реакционную смесь пары праймеров – коротких нуклеотидных последовательностей, которые комплементарны к 3′-концам каждой из цепочек копируемого фрагмента ДНК. Праймеры являются своеобразными лимитирующими факторами ДНК-полимеразы на вновь синтезируемой копии ДНК. После фиксации праймер становится 5′-концом вновь синтезируемой копии и от него начинается синтез новой цепочки посредством ДНК-полимеразы в направлении 5′ → 3′. В качестве строительного материала для построения новых фрагментов нуклеиновой кислоты используются предварительно внесенные в раствор свободные мононуклеотиды.

Весь цикл полимеразной цепной реакции включает несколько этапов, каждый из которых обусловливается определенным температурным оптимумом.

Изначально, в условиях высокой температуры, происходит денатурация молекулы ДНК, т.е. деспирализация и разделение комплементарных цепей. После снижения температуры реакционной смеси происходит фиксация праймеров к 3′-концам амплифицируемых фрагментов. Этот процесс называется отжигом праймеров.

В последующем идет образование двух новых нуклеотидных цепочек посредством ДНК-полимеразы. Дальнейший отжиг праймеров происходит не только на исследуемых фрагментах ДНК, но и на вновь синтезируемых. Поэтому для синтеза новых нуклеотидных последовательностей используется не только анализируемая ДНК, но и ранее образованные копии. С каждым последующим циклом количество вновь синтезируемых копий начинает преобладать над исходной ДНК, вследствие чего отжиг праймеров осуществляется, главным образом, на дочерних фрагментах ДНК. Для амплификации пригодна даже деградированная ДНК, при условии сохранения в ней фрагмента, включающего участки для присоединения праймеров.

Процессу амплификации может быть подвергнут любой локус ДНК, при условии, что последовательность нуклеотидов в нем известна, а значит существует возможность создания соответствующих праймеров. В настоящее время исследуют локусы генов главного комплекса гистосовместимости (HLA), либо STR-локусы, которые характеризуются малым количеством нуклеотидов в повторе. Необходимо отметить, что исследование по одному локусу в очень редких случаях может быть недостоверным, вследствие возможного совпадения нуклеотидных последовательностей, поэтому, во избежание ошибочных результатов, исследование проводят, как правило, по двум-трем локусам.

Результатом полимеразной цепной реакции является образование множества копий заданного локуса ДНК (см. Приложение). Далее производят анализ либо полиморфизма длины вновь синтезированных фрагментов, либо анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей в них.

Полиморфизм длины рестрикционных участков выявляют с помощью электрофореза в агаровом или полиакриламидном геле (АГ, ПААГ). Распределение амплифицированных копий ДНК в геле зависит от их длины, молекулярной массы, а значит и электрофоретической подвижности. Относительно  короткие фрагменты, обладая значительной подвижностью, перемещаются на большее расстояние от места старта. Фрагменты, имеющие достаточно высокую молекулярную массу, отличаются ограниченной подвижностью в электромагнитном поле. Для контрольного сравнения в процессе электрофореза в одну из лунок геля вносят маркеры – фрагменты ДНК с заведомо известной длиной. После обработки геля ядерным  красителем, например, бромистым этидием, исследуемые фрагменты визуализируются в УФ-свете в виде параллельно расположенных полосок, отстоящих друг от друга на различном расстоянии. Если человек гомозиготен по исследуемому локусу, то анализируемому фрагменту ДНК будет соответствовать одна полоска, если гетерозиготен –  то две. Совокупность полосок, соответствующих исследуемым участкам ДНК, именуется штрих-кодом, который индивидуален у каждого человека и остается неизменным в течение жизни.

Путем сравнения штрих-кодов методом математического анализа устанавливают вероятность происхождения того или иного биологического объекта от конкретного человека, или биологическое родство индивидуумов.