Биологические особенности госпитальных штаммов сальмонелл

Возбудитель инфекции — крайне важная составляющая эпидемического процесса. Характеристики сальмонеллеза как ВБИ определяются биологическими свойствами возбудителей. Практически все описанные вспышки НС (за исключением пищевых) вызывают возбудители, обладающие одним общим свойством — множественной устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам, в первую очередь — к антибиотикам (Phillipon A. etal., 1989; Этиология сальмонеллезов…, 1994; Kam Kai-Man, 1996; Metzer E. etal.).

Биохимические свойства сальмонелл. Культуры сальмонелл, которые выделялись при внутрибольничных вспышках, подвергались серьезному изучению. Особенно пристальное внимание исследовате­лей привлек S. typhimurium — ведущий возбудитель НС. Изучение культур S. typbimurium, вызывавших вспышки в стационарах, было начато в 1950 г. В.А/ Арбузовой. Ею выявлено важнейшее отличительное свойство этих штаммов — меньшая, чем у других штаммов, вирулентность для белых мышей при их энтеральном заражении и при заражении через дыхательные пути (Арбузова В А, 1968). Можно предполагать, что у госпитальных штаммов в какой-то мере происходит утрата адаптации к животным. Кроме этого определяющего признака В.А. Арбузова выявила и некоторые биохимические особенности госпитальных штаммов сальмонелл, в частности, способность абсолютного их большинства разлагать инозит в 1-е сутки нахождения в субстрате. Указанные культуры были обозначены как II тип (в отличие от I — типичного классического варианта), а в последующем — IIR.

Подтвердились данные об определенной специфике биохимичес­кой активности разных штаммов сальмонелл. Выявлены 6 вариантов (разновидностей), из которых доминирующая роль в формировании госпитальных вспышек принадлежит варианту «а» (арабиноза-, мальтоза-, рамноза-, ксилоза-, дульцит-, сорбит-, инозит-, лизинположительные в 1-е сутки), однако изредка вспышки могут быть вызваны и дру­гими разновидностями S. typhimuriutn, поэтому биохимические метки, будучи стабильными, имеют значение при установлении эпидемиоло­гических связей, но не всегда однозначно свидетельствуют о «госпитальности» штамма (Энтеробактерии, 1985; Рожнова С.Ш. и др., 2000).

Нами исследованы госпитальные штаммы S. typhimuriutn, изолированные от больных и из внешней среды в процессе наблюдения за длительно (33 мес) существовавшим эпидемическим очагом НС в одном из крупных многопрофильных стационаров для взрослых г. Москвы. Все выделенные в процессе эпидемиологического наблюдения культуры S. typhimurium имели типичную для сальмонелл морфологию и серологические свойства. При изучении 2584 культур S. typbimuriutn установлена идентичность биохимических свойств подавляющего числа (97.2%) выделенных штаммов и их принадлежность к варианту «а».

Очень существенно отношение S. typbimurium к индикаторным фагам. Оказалось, что к международному набору фагов Феликса и Келлоу штаммы IIR резистенты и поэтому нетипируемы. В Тбилисском НИИ вакцин и сывороток разработан свой набор индикаторных фагов для типирования S. typhimurium (Килессо ВА и др., 1981), с помощью которого удалось установить, что большинство госпитальных штаммов относится к 20-му фаговару, но встречаются изредка также 25, 29 и 30-й фаговары. 20-й фаговар набора Тбилисского НИИВС идентичен фаговару № 208 набора Андерсона. Абсолютное большинство зарубежных вспышек вызывается именно этим фаговаром (Яфаев Р.Х., 1989).

Антнбиотикорезистентность. Значительная часть вспышек НС, ранее описанных в литературе, связана с полиантибиотикорезистентными штаммами S. typhimurium (Килессо В А и др., 1976, 1986; Покровский В.И. и др., 1981; Семина НА и др., 1990). Указанная тенденция сохраняется и в настоящее время. В этиологической структуре НС, согласно официальным данным городского центра Госсанэпиднадзора, в период с 1996 по 2000 г. в Москве преобладал серовариант S. typhimurium, 2-е и 3-е ранговые места в разные годы принадлежали серовариантам S. enteritidis и S, haifa (табл. 3).

Известны вспышки ВБИ, вызванной полирезистентными штаммами сальмонелл других сероваров: 5. enteritidis и S. agona — в Польше, 5. virchow — в Англии, S. newport — в Индии и Перу, S. isangi — в Заи­ре, S. alacbua и S. anatum — в Индии, S. ропота — во Франции, 5. derby и S. Portsmouth — в Китае, S. tvienв Тунисе, S. bocfoum и S. brockey — в Испании, 5. infantis — в США и др. (Corrado MX. et al, 1996; Fernan­dez G.M.L etal, 1996; Kam Kai-Man, 1996).

Отмечая высокую резистентность госпитальных штаммов различного происхождения к антибиотикам, исследователи указывают, однако, что спектр их устойчивости (чувствительности) не совсем тождествен (Информационный бюллетень…, 1995; Vahaboglu H. et al, 1996; Милютина Л.Н. и др., 1997). У преобладающего числа выделя­емых госпитальных штаммов отмечается устойчивость к целому ряду антибиотиков (левомицетину, канамицину, ампициллину, тетрацик­лину, стрептомицину, гентамицину, ко-тримоксазолу) в концентрации, превышающей 100 мкг/мл (Покровский В.И. и др., 1989; Информацион­ный бюллетень…, 1995). В последние годы особое беспокойство вызывает появление и распространение устойчивости не только к перечисленным выше традиционно применяемым антибиотикам, но и к цефалоспоринам III поколения, что приводит к серьезным трудностям в лечении генерализованных и локализованных внекишечных форм сальмонеллезной инфекции (Этиология сальмонеллезов…, 1994; Сидоренко СВ., 1997).

Устойчивость к цефалоспоринам III поколения, как правило, связана с плазмидными B-лактамазами расширенного спектра. Так, в Мадриде описана вспышка сальмонеллеза в педиатрическом стационаре, вызванная штаммом цефтазидимрезистентной S. enterica subsp. enterica серотипа Othmarschen. Устойчивость была связана с наличием плазмидной B-лактамазы ТЕМ-27 (Morosini МЛ. et al., 1996). Описано формирование резистентности у S. enteritidis к цефотаксиму в процессе лечения этим антибиотиком; причиной явилась также B-лактамаза расширенного спектра (Сидоренко СВ., 1997). Описана вспышка неонатальных гастроэнтеритов и менингитов в нескольких стационарах Стамбула, вызванная S. typhimurium, обладавшей B-лактамазой расширенного спектра PER-1 (Vahaboglu H. et al, 1996). Близкородственная р-лактамаза PER-2 обнаружена у штамма S. typhimurium в Аргентине. Исследователями описаны B-лактамазы ТЕМ-1 и SHV-2, обеспечивающие полиантибиотикорезистентность госпитальных штаммов сальмонелл к цефалоспоринам III поколения, монобактамам, аминогликозидам, триметоприму, хлорамфениколу (Сидоренко СВ., 1997). Описаны B-лактамаза СТХ-1 (ТЕМ-3), обеспечивающая резистентность госпитальных штаммов S. typhimurium к большому числу цефалоспоринов , и СТХ-М-5, обеспечивающая устойчивость к цефотаксиму (Bradford P.A. et al, 1998).

Попытка классифицировать B-лактамазы предпринята G.Revathi et al. (1998). Они выделили две группы B-лактамаз расширенного спектра, описанных ранее и характерных, по мнению авторов, для госпитальных штаммов сальмонелл: в 1-ю группу вошли ферменты DHA-1 и CMY-2, во 2-ю — SHV-1, SHV-2, SHV-5, ТЕМ-3, ТЕМ-25, ТЕМ-27, СТХ-М2, НА-1 и НА-2.

В последние годы зарубежные исследователи стали часто упоми­нать об особо устойчивом к действию антибиотиков госпитальном штамме S. typhimurium, обозначаемом в литературе как

DT 104. Ряд авторов свидетельствуют, что для этого штамма характерна устойчивость к воздействию фторхинолонов, чего ранее никогда не отмечалось у госпитальных штаммов (Ridley A. et al, 1998; Chen Y.H. et al, 1999). Расширение спектра лекарственной устойчивости S. typhimurium делает лечение сальмонеллезной инфекции серьезной проблемой для ученых и практиков.

В Российской Федерации также отмечается высокая частота антибиотикорезистентности сальмонелл. В Санкт-Петербурге и Ленинградской области в период 1984-1991 гг. проявляли устойчивость хотя бы к одному из традиционно используемых антибиотиков (ампициллину, хлорамфениколу, аминогликозидам) более 90% штаммов S. haifa, 47.3% штаммов S. typhimurium, 6.6% штаммов S. enteritidis-, штаммов, устойчивых к ципрофлоксацину, выделено не было, данные об устойчивости к цефалоспоринам III поколения отсутствуют (Этиология сальмонеллезов…, 1994; Информационный бюллетень…, 1995). В этом же регионе в 1995-1996 гг. описано выделение из сточных вод животноводческой фермы и при внутрисемейной вспышке сальмонеллеза 6 штаммов S. typhimurium, устойчивых к цефотаксиму и цефтриаксону, обладавших B-лактамазой, родственной ферментам, описанным выше (PER-1, PER-2). Анализ выделенных штаммов с помощью электрофореза макрорестрикторов хромосомной ДНК в переменном поле выявил их полную клональную идентичность. Все штаммы проявляли ассоциированную устойчивость к тетрациклинам, хлорамфениколу, ко-тримоксазолу, гентамицину, но сохраняли чувствительность к ципрофлоксацину (Этиология сальмонеллезов…, 1994; Информационный бюллетень…, 1995).

Среди исследованных нами культур S. typhimurium, выделенных от больных сальмонеллезом в ходе эпидемиологического наблюдения за очагом, 1.9-2.5% отличались высокой чувствительностью практически ко всем используемым антибиотикам, но более 97% характеризовались выраженной антибиотикорезистентносгью, имевшей идентичный спектр (табл. 4). Следует отметить, что основное количество выделенных штаммов S. typbimurium были полностью резистентны к 18 из 27 исследуемых антибиотиков. На протяжении всей хронической эпидемии выделяемые штаммы были чувствительны к препаратам фторхинолонового ряда, карбапенемам, полимиксину-М и умеренно чувствительны к ряду препаратов группы аминогликозидов II и III поколений (гентамицину, нетилмицину, амикацину), цефалоспорину IV поколения цефепиму.

В ходе наблюдения за хронической эпидемией по данным антибиотикограмм установлено снижение чувствительности сальмонелл к ряду антибиотиков, в частности аминогликозидам. Сроки возникновения устойчивых штаммов возбудителя при изначально высоком уровне чувствительности к антибиотику для разных препаратов различны: так, для гентамицина и нетилмицина они составили около 6-7 мес, амикацина — 23-25 мес. Важно подчеркнуть, что данные антибиотики не использовались в качестве этиотропной терапии сальмонеллеза.

Плазмидный профиль. Формирование множественной лекар­ственной устойчивости обусловлено наличием у госпитальных штаммов конъюгативной R-плазмиды (Покровский В.И. и др., 1989; Vahabog-lu H. et al, 1996; Сидоренко СВ., 1997). Основной механизм лекар­ственной устойчивости, сообщаемой бактериям R-плазмидами, — приобретение клетками способности синтезировать энзимы, разрушающие лекарственный препарат (Покровский В.И. и др., 1982; Сидорен­ко СВ., 1997). Широкое распространение множественной лекарственной устойчивости, детерминированной R-плазмидами, обусловлено в основном их селекционными преимуществами, связанными со способностью передавать устойчивость одновременно ко многим антибактериальным препаратам, используемым в клинической практике, а также со способностью R-плазмид передаваться посредством конъюгации между бактериями, принадлежащими к разным типам, видам, родам и даже семействам (Энтеробактерии, 1985; Справочник…, 1999).

1енетические исследования госпитальных штаммов, проводимые в разных странах, позволили установить неоднородность молекулярных масс плазмидных ДНК Исследователями описаны плазмиды госпиталь­ных штаммов сальмонелл с молекулярной массой 38 МД (Rushdy AA et al, 1997), 65 МД (Сидоренко СВ., 1997), 81 МД (Vahaboglu H. et al, 1996), 59 kb (Morosini M.I. et al, 1996), 98.0, 6.76 и 3.8 kb (Yang Chin-Hui etal, 1996).

Нами исследован плазмидный профиль части выделенных штаммов S. typhimuriutn. В референс-коллекцию включены 62 культуры. В результате проведенного исследования выявлены типичный и нетипичный плазмидные профили. Типичный плазмидный профиль характерен для большинства (95.2%) исследованных штаммов и представлен тремя плазмидами размерами 128.7, 17.4 и 2.4 kb. Наличие плазмиды вирулентности размером 128.7 kb свидетельствует об антропонозном происхождении возбудителя сальмонеллеза и, что характерно для плазмид такого размера, о возможном включении в геном фактора антибиотикорезистентности. Нетипичный профиль имели три штамма, выделенных от больных: содержащий одну плазмиду размером 128.7 kb; содержащий две плазмиды размерами 137.4 и 2.4 kb и бесплазмидный. Последний из нетипичных профилей получен от пациента после курса лечения фторхинолонами, хотя до  проводимой терапии от данного больного изолировались культуры с типичным профилем. Обнаружение нетипичных плазмидных профилей позволяет предполагать регулярность заносов инфекции извне на фоне хронической эпидемии НС. Коэффициент неоднородности популяции составил 0.05, что позволяет говорить о циркуляции именно госпитального штамма S. typhimurium.

Дальнейшее изучение и сопоставление спектра плазмид исследуемых штаммов позволило выявить идентичность плазмидных профилей штаммов, как выделенных от больных, так и обнаруженных во внешней среде (смывы с поверхности прикроватного столика и настольной лампы). Данный факт свидетельствует об обсемененности внешней среды госпитальными штаммами сальмонелл.

Анализ плазмидных профилей штаммов, выделенных от персонала стационара, также показал полное совпадение их спектров с типичным плазмидным портретом штаммов, выделенных от пациентов.

Дополнительные факторы вирулентности. Подавляющая часть госпитальных штаммов S. typhimurium, выделенных в период хронической эпидемии, — 141 (92.8%) из 152 изученных — обладали антилизоцимной активностью (исследования проведены совместно с проф. В.МБондаренко). Указанное свойство характерно для 12 (75%) из 16 изученных штаммов S. typhimurium, изолированных от больных, не связанных с эпидемическими очагами НС.

В опытах с праймерами гена invA у 90.8% (89 из 98 изученных) госпитальных штаммов S. typhimurium выявляется положительная реак­ция. Наличие гена invA коррелирует с адгезивной (898%) и инвазивной способностью (86.7%) сальмонелл и подтверждает сохранение патогенного потенциала возбудителя.

Способность 5. typhimurium продуцировать IgA-протеазу исследовали с помощью реакции агрегатгемагглютинации и полимеразной цепной реакции (ПЦР). У музейных эталонных штаммов S. typhimurium не обнаружено iga-гсноъ ни в хромосоме, ни в собственной плазмиде молекулярной массой 60 Щ. Госпитальные штаммы дали положительную реакцию на наличие iga-геноъ в 636% случаев (49 из 77 изучен­ных штаммов, табл. 5). При элиминации сложных R-плазмид у одного из госпитальных штаммов S. typhimurium бесплазмидный вариант утратил положительную реакцию с праймерами iga-генх Это позволяет говорить о наличии у данного штамма сложной R-плазмиды, приобретенной в результате генетического обмена. Указанное свойство у госпитальных штаммов S. typhimurium выявлено и описано нами впервые.

В процессе хранения и пересевов культур S. typhimurium, как и патогенных бактерий других видов, отмечается утрата вирулентности, связанная с явлением сегрегации генов, определяющих экспрессию па­тогенных свойств. Это позволяет объяснить тот факт, что способность к синтезу IgA-протеазы обнаружена лишь у 63.6% госпитальных штаммов S. typbimurium, несмотря на однородность их молекулярно-генетических характеристик (95.2%). Утрата вирулентности происходит вне организма хозяина, чувствительного к возбудителю, в связи с чем требуется либо пассирование штаммов через организм чувствительных лабораторных животных, либо хранение культур в лиофильно высушенном состоянии.

Локализация возбудителя в организме заболевших. При рассмотрении различных клинических форм и вариантов инфекции важно учитывать, что возбудитель инфекции выделяется не только из кала и крови (при бактериемии), но и из других биологических жидкостей организма заболевших (табл. 6).

Устойчивость к факторам внешней среды. Эта особенность является значимой для характеристики возбудителя, понимания специфики динамики проявлений эпидемического процесса и длительности существования эпидемических очагов НС. Госпитальные штаммы S. typbimurium приобрели значительную устойчивость к воздействию высоких концентраций традиционно используемых дезинфицирующих средств (табл. 7). В практической деятельности получен хороший эффект при использовании современных и удобных в применении препаратов на основе четвертичных аммониевых соединений (препараты группы «Септодор»).

Наряду с высокой устойчивостью выделенных штаммов S. typhimurium к обычным концентрациям традиционно используемых дезинфектантов важным свойством возбудителя является длительная сохраняемость на объектах внешней среды. Необходимо отметить, что в процессе наблюдения за длительно существовавшим эпидемическим очагом НС на фоне ежедневного проведения дезинфекционных мероприятий S. typhimurium с характерными свойствами выделялись при смывах с объектов внешней среды палат, секторов реанимации через 60-80 дней после окончания регистрации манифестных форм заболеваний в стационаре. Безусловно, одним из важнейших резервуаров инфекции является палатная пыль, в которой длительное время сохраняется возбудитель. Так, при исследовании пыли из труднодоступных мест палатных секций одного из хирургических отделений S. typhimurium была выделена через 127 дней после регистрации последнего заболевшего НС в данной палате. Данное свойство возбудителя в значительной степени определяет длительность существования эпидемического очага НС и сроки его полной ликвидации, свидетельствуя о важной роли «госпитальной среды» в его формировании.

Таким образом, очевидно, что госпитальные штаммы сальмонелл (в большей степени S. typhimurium) представляют собой особую биологическую разновидность, характеризующуюся рядом свойств, позволяющих дифференцировать их от обычных штаммов соответствующих сероваров. Госпитальные штаммы обладают способностью обусловливать внутрибольничные очаги инфекции, характеризующиеся определенными особенностями течения эпидемического процесса, отличающими их от классической сальмонеллезной инфекции (Покровский В.И. и др., 1989). Специфика госпитальных штаммов S. typhimurium во многом определяет характер и тяжесть течения инфекционного процесса, ведущие пути и факторы передачи инфекции в стационаре для взрослых, длительность и особенности проведения комплекса противоэпидемических мероприятий по ликвидации очагов НС